Next: Wielobiałkowe maszyny komórkowe zaangażowane Up: Organizacja chromatyny Previous: Składanie nukleosomów w chromatynie   Spis rzeczy

Nukleosomy jako regulatory transkrypcji

Kwestią o zasadniczym znaczeniu dla żywotnych procesów biochemicznych zachodzących z udziałem DNA, przede wszystkim transkrypcji, jest zdolność wiązania się czynników transkrypcyjnych do chromatyny, w odpowiedzi na zmiany stanu fizjologicznego komórki. Chromatyna ma różnoraki wpływ na proces transkrypcji, poczynając od nukleosomów uniemożliwiających wiązanie określonych transkrypcyjnych białek regulatorowych i czynników inicjacyjnych, a na przeszkodach dla elongacyjnego działania polimerazy II RNA kończąc (Workman i Buchman, 1993).

Komórki eukariotyczne mogą przyjąć co najmniej dwie strategie wobec nukleosomów blokujących transkrypcję genów: mogą je usunąć na trwałe (lub nie dopuścić do ich utworzenia), lub usuwać je pod wpływem określonego bodźca.

Usunięcie nukleosomów na stałe lub niedopuszczenie do ich utworzenia się jest związane z wytworzeniem w sąsiedztwie promotorów obszaru, trwale wolnego od nukleosomów. Takie obszary trwale pozbawione nukleosomów występują na promotorach genów transkrybowanych konstytutywnie. Mogą one powstać wskutek działania stale obecnych czynników, zadaniem których jest usuwanie nukleosomów (Rys. 9). W tym ostatnim przypadku, czynniki te muszą uzyskać kontakt z miejscami wiązania w momencie, gdy są one wolne od nukleosomów, na przykład bezpośrednio po replikacji DNA, a przed składaniem nukleosomów (patrz poprzednia część Wstępu). Z sytuacją tego typu spotykamy się w przypadku promotorów genów szoku

cieplnego (m. in. hsp70) Drosophila, wiążących czynnik GAGA, który jest niezbędny do zapewnienia dostępu zarówno do samego promotora, jak i poprzedzających (ang. upstream) elementów regulatorowych (Gilmour i wsp., 1989).

Strategia usuwania nukleosomów pod wpływem bodźca polega na takim bezpośrednim lub pośrednim działaniu czynników regulacyjnych, które usuwa nukleosomy związane zarówno z poprzedzającymi miejscami wiązania dla czynników białkowych, jak i z sekwencjami promotorów. Z takim niezależnym od replikacji DNA mechanizmem mamy do czynienia w przypadku drożdżowego promotora PHO5, obejmującego cztery nukleosomy o ustalonej pozycji (Schmid i wsp., 1992). PHO5 jest genem kodującym kwaśną fosfatazę, który ulega indukcji w nieobecności fosforanu w środowisku. W trakcie indukcji układ nukleosomów położonych na promotorze ulega zaburzeniu. W stanie zablokowanym jeden z nukleosomów (nuc-2) przykrywa dwa miejsca wiązania dla aktywatorów białkowych PHO2 i PHO4; inne miejsce wiązania położone jest na DNA leżącym pomiędzy pierwszym a kolejnym nukleosomem od strony 5 (nuc-3). Podczas aktywacji genu PHO5, białko PHO4 wiąże się do miejsca w łączniku i współdziałając z białkiem PHO2  usuwa sąsiadujący nukleosom (nuc-2), co powoduje odsłonięcie drugiego miejsca wiązania dla PHO4 (Almer i Hörz, 1986).  W procesie pobudzania transkrypcji związanej z genem PHO5 i przebudową represyjnej struktury nukleosomowej ważną rolę pełnią także ogony histonów rdzeniowych (patrz wcześniejsza część Wstępu). Na przykład w szczepach drożdży z zablokowaną syntezą histonu H4, lub z H4 pozbawionym ogonów, dochodzi do silnej indukcji genu PHO5 (Han i Grunstein, 1988). Podobnej aktywacji ulega również duża grupa innych genów, takich jak CUP1 i HIS3, co świadczy, że również one (lub ich promotory) podlegają represji nukleosomowej.

Z podobnym systemem usuwania nukleosomów pod wpływem zewnętrznego bodźca mamy do czynienia w przypadku promotorów mysiego wirusa guzów sutka (MMTV, ang. mouse mammary tumor virus) i promotora genu aminotransferazy tyrozynowej szczura. W skład obszarów organizowanych na tych promotorach przez nukleosomy wchodzą sekwencje odpowiedzi na glukokortykoidy. Pod wpływem stymulacji hormonalnej nukleosomy ulegają przebudowie (Carr i Richard-Foy, 1990); w trakcie tego procesu do specyficznie pozycjonowanej na promotorze cząstki rdzeniowej nukleosomu (Nuc-B) przyłącza się białko receptora glukokortykoidowego (GR).  Następnym etapem aktywacji jest związanie do nukleosomu jądrowego czynnika 1 (NF1), co powoduje usunięcie sześciu pozycjonowanych nukleosomów, utworzenie kompleksu preinicjacyjnego. I  rozpoczęcie transkrypcji (Archer i wsp., 1991; Lee i Archer, 1998).

Część genów wykorzystuje oba mechanizmy usuwania nukleosomów. I tak, w obszarze regulacyjnym genów GAL1/GAL10 drożdży Saccharomyces cerevisiae znajduje się obszar trwale wolny od nukleosomów. Z obszarem tym wiąże się konstytutywnie wyrażany czynnik białkowy GRF2, zajmując także miejsca wiązania indukowalnego białka GAL4 (Fedor i wsp., 1988; Taylor i wsp., 1991). W ten sposób obszar ten jest dostępny dla podstawowego aparatu transkrypcyjnego, chociaż sama sekwencja TATA promotorów genów GAL1 i GAL10 jest zablokowana przez nukleosomy. Dimeryczne białko GAL4 (lub jego pochodne) wiąże się w sposób kooperatywny do nukleosomów, powodując ich destabilizację i aktywację transkrypcji. A zatem, o ile w poprzedzającej sekwencji regulatorowej nukleosomy są trwale usunięte, to w przypadku centralnej części promotorów muszą one ulec wyparciu w odpowiedzi na bodziec.

 W utrzymaniu obszarów wolnych od nukleosomów uczestniczyć mogą również inne białka zdolne do specyficznego oddziaływania z sekwencjami promotorów lub wzmacniaczy transkrypcji (ang. enhancer). Tego typu czynniki mają zdolność do wiązania się do DNA i tworzenia kompleksów z innymi białkami lub do dimeryzacji ze sobą. Białkiem takim jest między innymi Sp1 (Saffer i wsp., 1991). I tak, na zrekonstruowanych minichromosomach małpiego wirusa 40 (SV40) dwie cząsteczki białka Sp1 uczestniczą w wytwarzanie obszarów wolnych od nukleosomów.

Nukleosomy mogą mieć również pozytywny wpływ na proces transkrypcji. Silnie spozycjonowany nukleosom związany z promotorem genu witellogeniny B1 Xenopus umożliwia takie nawinięcie DNA, które zbliża odległe miejsca wiązania dla receptorów estrogenu do bliskich sekwencji promotorowych (Schild i wsp., 1993). Powoduje to wytworzenie pętli, w której sekwencje te znajdują się blisko siebie, co wzmacnia aktywację transkrypcyjną z tego promotora.

Kwestią o kluczowym znaczeniu dla transkrypcji w kontekście chromatyny jest pytanie, w jaki sposób polimeraza RNA może przemieszczać się po matrycy zorganizowanej przez nukleosomy. Badania nad transkrypcją genów ?-globiny, nawiniętych na nukleosomy i transkrybowanych przez polimerazę II RNA  (Felsenfeld, 1992), pozwoliły na zaproponowanie kilku konkurencyjnych modeli rozwiązania tego problemu strukturalnego (Felsenfeld i wsp., 1996). W pierwszym z nich oktamer histonowy pozostaje na swoim miejscu, przypuszczalnie utrzymując się na nici DNA nie podlegającej transkrypcji. Drugi model zakłada, że oktamer ulega rozpadowi i rozprasza się w roztworze, zaś trzeci, że odsuwa się przed przemieszczającą się polimerazą. Wreszcie czwarty model przyjmuje, że oktamer odrywa się od nici DNA, a następnie ponownie się z nią wiąże. W celu zbadania tych możliwości Clark i Felsenfeld (1992) skonstruowali system badań in vitro, w którym połączyli pojedynczą cząstkę nukleosomową z plazmidem w ten sposób, że była ona umieszczona pomiędzy promotorem polimerazy Sp6, a sekwencją terminacji transkrypcji. Wykorzystując ten układ udało się wykazać, że poprawny jest wyłącznie ostatni model, przy czym udowodniono również, że transfer oktameru zachodzi wskutek kontaktu z sekwencją DNA położoną po drugiej stronie transkrybującej polimerazy (Studitsky i wsp., 1994; Studitsky i wsp., 1995; Rys. 10).

Najważniejszą cechą opisanego sposobu omijania nukleosomów przez transkrybującą polimerazę jest mechanizm transferu oktameru histonowego z pozycji przed polimerazą do pozycji za nią, w sposób dzięki któremu oktamer nigdy nie traci kontaktu z DNA (Rys. 10). Ustalono również, że tempo przemieszczania się polimerazy po nici DNA zorganizowanej przez nukleosom jest zmienne i nie zależy od sekwencji DNA, lecz od pozycji zajmowanej przez enzym na powierzchni oktameru histonowego: polimeraza zwalnia swój ruch w chwili, gdy znajdzie się około 20 par zasad w głębi nukleosomu (po przepisaniu 20 par zasad nawiniętego na rdzeń nukleosomu), a po

osiągnięciu pozornej osi symetrii DNA w nukleosomie jej ruch ustaje całkowicie. Przypuszcza się, że w tej właśnie chwili oktamer zostaje przeniesiony. Mimo to, wydaje się, że nukleosomy nie stanowią zawady sterycznej dla polimerazy, a obserwowane spowolnienie ruchu polimerazy wynika raczej z powstawania skręconych struktur przestrzennych, zmieniających tempo przemieszczania się enzymu (Studitsky i wsp., 1995; Felsenfeld, 1996). Warto jednak zastrzec, że w układach eukariotycznych przesuwanie się polimerazy uzależnione jest od istnienia innych mechanizmów wspomagających. Może do nich należeć m. in. acetylacja histonów (patrz wcześniejsza część Wstępu) lub udział  kompleksów destabilizujących strukturę oktameru (patrz część następna).


Next: Wielobiałkowe maszyny komórkowe zaangażowane Up: Organizacja chromatyny Previous: Składanie nukleosomów w chromatynie   Spis rzeczy
Tomasz Calikowski 2000-06-15