Next: Wyspecjalizowane aktywujące i reprymujące Up: Organizacja chromatyny Previous: Nukleosomy jako regulatory transkrypcji   Spis rzeczy

Wielobiałkowe maszyny komórkowe zaangażowane w przebudowę struktur chromatynowych

Chromatyna wywiera represyjny wpływ na proces transkrypcji. W ewolucji doszło do wykształcenia wyspecjalizowanych kompleksów białkowych, zdolnych do przebudowy struktur chromatynowych. Zawierają one zwykle wiele białek. Do tej pory poznane zostały u muchówek, drożdży i człowieka (Cairns, 1998; Tyler i Kadonaga, 1999; Pazin i Kadonaga, 1997).

U Drosophila poznano trzy takie kompleksy: czynnik przebudowy nukleosomów (NURF, ang. nucleosome remodeling factor) (Tsukiyama i Wu, 1996), kompleks dostępności do chromatyny (CHRAC, ang. chromatin accessibility complex) (Varga-Weisz i wsp., 1995), i ATP-zależny czynnik składania i przebudowy chromatyny (ACF, ang. ATP dependent chromatin assembly and remodeling factor) (Ito i wsp., 1997). Z kolei u drożdży poznano kompleks SWI/SNF (Cairns i wsp., 1994), jak i spokrewniony z nim kompleks remodelowania chromatyny RSC (ang. remodels the structure of chromatin) (Cairns i wsp., 1996). Wszystkie one zdolne są do przebudowy struktur chromatynowych, lecz sposób ich działania jest różny w warunkach in vitro, co sugeruje że in vivo pełnią one odmienne role w procesie składania chromatyny i regulacji transkrypcyjnej.

Badania regulacji transkrypcji u drożdży pozwoliły na odkrycie licznych genów związanych z niezdolnością do zmiany typu płciowego lub z niemożnością fermentacji sacharozy. Pierwsze z nich nazwano SWI (od ang. switch), drugie zaś SNF (od ang. sucrose non-fermenting) (Breeden i Nasmyth, 1987). Produkt jednego z genów pierwszej grupy, SWI2, okazał się identyczny z produktem genu z grupy drugiej i nosi odtąd nazwę SWI2/SNF2. Polipeptyd ten posiada siedem konserwowanych motywów białkowych obecnych w dużej grupie białek wiążących trifosforany nukleotydów. Do tej grupy białek zaliczają się również helikazy DNA i RNA. W dalszych pracach okazało się, że białko to współdziała z innymi partnerami (SWI1/ADR6, SWI3, SNF5 i SNF6) tworząc z nimi kompleks białkowy o masie bliskiej dwóm megadaltonom, niezbędny do właściwej kontroli transkrypcyjnej  (Peterson i Herskowitz, 1992; Cairns i wsp., 1994). Supresorami mutacji swi i snf są między innymi mutacje w genach biosyntezy histonów, co wskazuje, że białka SWI i SNF przeciwdziałają represji nukleosomowej (Winston i Carlson, 1992). Ponadto stwierdzono, że brak białka SWI2/SNF2 lub SWI5 powoduje obniżenie transkrypcji genu SUC2, oraz zmianę okolicy promotora tego genu, zaś oba efekty można odwrócić poprzez obniżenie poziomu histonów H2A i H2B (Hirschhorn i wsp., 1992). Istnieje również doniesienie wskazujące na obecność kompleksu SWI/SNF w bliskim otoczeniu holoenzymu polimerazy II RNA (Wilson i wsp., 1996), chociaż inne prace poddały ten wniosek w wątpliwość (Cairns i wsp., 1996).

Kompleks homologiczny do SWI/SNF wyizolowano również z komórek ludzkich (Wang i wsp., 1996), zaś u Drosophila odkryto pokrewny mu kompleks brahma (brm), zawierający homolog białka SNF2/SNF2  białko brm (Tamkun i wsp., 1992). Kompleks brahma zawiera co najmniej siedem podjednostek, w tym ATPazę. Białko to związane jest z regulacją genów homeotycznych, pełniących niezwykle ważne funkcje podczas różnicowania komórek i rozwoju. Podobne białka, BRG-1 lub konkurujące z nim białko BRM, występuje także u ssaków, łącząc się ze specyficznymi czynnikami BAF, takimi jak IN1, BAF170 i BAF155 (Wang i wsp., 1996; Travers, 1999). Włączenie ich do kompleksu BRG1 w znaczny sposób podnosi jego aktywność, szczególnie tę związaną ze zmianą topologii DNA. Niedawno przeprowadzono doświadczenie, w którym wytworzono linię transgenicznych myszy, całkowicie pozbawionych genu i białka BRM (Reyes i wsp., 1998). Stwierdzono, że homozygotyczne myszy BRM-/- rozwijały się normalnie, chociaż były cięższe o 15% od zwierząt kontrolnych z tego samego miotu. Ponadto, pochodzące z nich fibroblasty wykazywały niezdolność do zatrzymania się na granicy faz G0/G1 cyklu komórkowego. Wyniki te świadczą o udziale białka BRM w proliferacji komórek. Wskazuje również na to zdolność tworzenia przez białko BRG1 kompleksu z produktem genu supresora nowotworowego, Retinoblastoma (RB) (Dunaief i wsp., 1998). Oba białka znajdujące się w kompleksie współdziałają przy hamowaniu cyklu komórkowego. Białko brahma wchodzi ponadto w skład multimerycznych kompleksów trithorax, odkrytych po raz pierwszy u Drosophila melanogaster (patrz dalsza część Wstępu).

Homologi drożdżowych składników kompleksu SWI/SNF wykryto również u roślin (Brzeski i wsp., 1999). Białko BSH z Arabidopsis thaliana ma masę 27 kDa i wykazuje wysoką homologię do odpowiednika drożdżowego genu SWI5, jak i do homologa z Caenorhabditis elegans i homologicznego białka INI1 człowieka (patrz dalej). Co ciekawe, znaczne obniżenie fizjologicznego poziomu białka BSH nie zmniejsza żywotności roślin, lecz wywołuje charakterystyczne zmiany fenotypowe, objawiające się krzaczastym pokrojem i niezdolnością do wydawania nasion. Natomiast u Drosophila całkowity brak homologa genu SWI5 jest letalny (Dingwall i wsp., 1995).

Innym członkiem rodziny SWI/SNF jest ludzki kompleks hSWI/SNF. Zawiera on około 10 podjednostek, w tym hSNF5/INI1, który jest bona fide represorem nowotworowym, często nieobecnym w bardzo złośliwych dziecięcych nowotworach siatkówki (Versteege i wsp., 1998). Funkcje biochemiczne składników hSWI/SNF są podobne do jego drożdżowego odpowiednika (Pazin i Kadonaga, 1997). Istotną różnicę stanowią jednak ich wymagania względem czynników niezbędnych do aktywacji ATPazy: podczas gdy kompleksy zawierające białko ISWI ulegają pobudzeniu wyłącznie przez nukleosomy, do stymulacji białka hSWI2 zdolne są zarówno nukleosomy, jak i wolny DNA.

Do rodziny białek SWI/SNF należy także drożdżowy kompleks remodelujący chromatynę RSC (Cairns i wsp., 1996). RCS ma masę bliską 1 MDa i zawiera 15 podjednostek, w tym ATPazę STH1, niezbędną do funkcjonowania całego kompleksu i homologiczną do białka SWI/SNF2. Homologię do składników kompleksu SWI/SNF wykazują jeszcze dwa inne polipeptydy kompleksu: RSC6 i RSC8. Kompleks RSC jest zdolny, podobnie jak SWI/SNF, do wywołania zależnych od ATP zmian oddziaływań histonów z DNA w zrekonstytuowanych mononukleosomach.  Tym co różni kompleks RSC od SWI/SNF jest wpływ, jaki na wzrost komórek drożdżowych wywierają mutacje w składnikach kompleksu: podczas gdy składniki SWI/SNF kodowane są przez geny, których obecność nie jest konieczna do wzrostu Saccharomyces cerevisiae, trzy komponenty RCS (RSC6, STH1 i RSC8) są kodowane przez geny konieczne do wzrostu (Laurent i wsp., 1992). Co więcej, w przeciwieństwie do SWI/SNF RSC wykazuje zdolność do przenoszenia oktameru histonowego z rdzeniowej cząsteczki nukleosomowej na nagi DNA (Lorch i wsp., 1999). Nowo uformowany kompleks oktameru z DNA wykazuje wszystkie cechy nukleosomu i powstaje z udziałem ATP.

Kolejną rodziną czynników przebudowujących chromatynę jest grupa kompleksów Mi-2/CHD, znana również jako rodzina CHD.  Jak dotąd, zaliczono do niej dwa kompleksy: Mi-2 (wyizolowany z Xenopus) i NuRD (wyizolowany z komórek ludzkich). Zawierają one od 6 do 7 podjednostek, w tym niezbędną do funkcjonowania ATPazę Mi-2/CHD (Tyler i Kadonaga, 1999). Białka CHD zawierają oprócz motywu helikazy dwa motywy strukturalne noszące miano chromodomeny, odpowiedzialne za oddziaływania z innymi białkami, oraz motyw PHD (homeodomeny roślinnej) lub inny motyw odpowiedzialny za wiązanie DNA (Travers, 1999). Chromodomeny występują w wielu białkach związanych z chromatyną (w tym w białku heterochromatynowym 1 (HP1) Drosophila i w białkach z grupy Polycomb (patrz dalsza część Wstępu)). Interesującą obserwacją było ustalenie, że kompleks NuRD posiada dwie podjednostki (HDAC1 i HDAC2) o aktywności deacetylazy histonowej (Xue i wsp., 1998; Lemon i Freedman, 1999). Kompleks ten wchodzi ponadto w bezpośrednie lub pośrednie oddziaływania z metylowanym DNA (Tyler i Kadonaga, 1999).

Z zarodków Drosophila wyizolowano również trzy kompleksy remodelujące chromatynę i wykazujące aktywność ATPazy: NURF, CHRAC i ACF. Należą one, wraz z drożdżowymi kompleksami ISW1 i ISW2 do rodziny ISWI, gdyż wszystkie zawierają ATPazę ISWI (ang. imitation SWI2), homologiczną do białka SWI2 (Ito i wsp., 1997; Tsukiyama i Wu., 1995; Eisen i wsp., 1995). Homologia ta ogranicza się jednak tylko do motywu helikazy, gdyż białko ISWI nie posiada motywu obecnego w karboksylowym końcu SWI2/SNF2, a noszącego miano bromodomeny (Jeanmougin i wsp., 1997). Domena ta służy do zapewnienia oddziaływań pomiędzy białkami. I tak, bromodomena obecna w białku SWI2 (lecz nieobecna w ISWI) wiąże się selektywnie do aminowych ogonów histonów H3 i H4 (Ornaghi i wsp., 1999). Sugeruje się jednak, że białko ISWI może kontaktować się z ogonami histonów H2A i H2B (Travers, 1999). Jak do tej pory nie wykazano zdolności białka ISWI do remodelowania chromatyny. Natomiast jego aktywność ATPazowa stanowi napęd maszynerii remodelującej. Wykazano, że ludzkie homologii SWI2/SNF2 (zawierające ISWI), BRG1 lub hBRM ułatwiają dostęp do DNA zorganizowanego w nukleosom, w sposób zależny od ATP i porównywalny z tym uzyskiwanym za pomocą całych kompleksów (Phelan i wsp., 1999).

NURF zawiera 4 podjednostki i jest zdolny do rozbijania struktury nukleosomu podczas aktywacji transkrypcyjnej. Pierwszego przykładu takiej aktywacji dostarczył model wiązania się in vitro czynnika GAGA do układu nukleosomów zajmujących promotor genu szoku cieplnego hsp70 u Drosophila (Tsukiyama i wsp., 1994). Kompleks NURF wykazuje wysoką specyficzność wobec DNA zorganizowanego w strukturę nukleosomową, przy czym ważną rolę w rozpoznawaniu nukleosomu przez NURF pełnią aminowe ogony histonów (Georgel i wsp., 1998), Stwierdzono również, że rozpoznawanie ogonów histonów przez NURF nie jest związane z ich acetylacją.

NURF nie posiada jednak zdolności do pozycjonowania nukleosomów. Taką aktywność posiada natomiast inny kompleks z rodziny ISWI: ACF. Zawiera on cztery podjednostki, w tym ATPazę ISWI i oprócz pozycjonowania nukleosomów zdolny jest do pośredniczenia w składaniu, a także przebudowie chromatyny (Ito i wsp., 1997). Do złożenia funkcjonalnej chromatyny ACF potrzebuje wyłącznie ATP, DNA, histonów oraz histonowego białka opiekuńczego Nap1 (patrz wcześniejsza część Wstępu), chociaż do pozycjonowania już złożonych nukleosomów Nap1 nie jest potrzebny.

Wydaje się, że proces odkładania nukleosomów w funkcjonalne struktury chromatynowe zachodzi w dwu etapach: w pierwszym z nich działają histonowe białka opiekuńcze niezależne od ATP, zaś w drugim  kompleksy pozycjonujące zawierające ATPazę (Cairns, 1998).

Ważna rola w organizacji struktur chromatynowych przypada kompleksowi CHRAC. Zawiera on siedem podjednostek, wykazując nie tylko aktywność ATPazy, jak pozostałe kompleksy remodelujące Drosophila, lecz także topoizomerazy DNA II (Varga-Weisz i wsp., 1997; Varga-Weisz i wsp., 1995; Corona i wsp., 2000). W jego skład, oprócz ATPazy ISWI, topoizomerazy II i polipeptydu o masie 175 kDa, wchodzą dwa małe białka o masie 14 kDa i 16 kDa, noszące odpowiednio nazwy MARY i JOEY (Corona i wsp., 2000). Wykazują one uderzające podobieństwo do domen zwoju histonowego, przypominając czynniki transkrypcyjne ssaków NF-YB i NF-YC, a także odpowiednio histony H2B i H2A. Co ciekawe, obie podjednostki CHRAC podlegają ścisłej regulacji podczas rozwoju Drosophila  ich ekspresja jest najwyższa we wczesnym rozwoju zarodkowym, zaś dramatycznie obniża się w stadium poczwarki i formy dorosłej owada. Regulacja tego typu może świadczyć o roli, jaką kompleks CHRAC pełni w kontroli podziałów komórkowych, w bezpośrednim ułatwianiu replikacji DNA chromosomów, lub poprzez zmiany wyższego rzędu struktur chromatynowych w kondensacji chromatyny w chromosomy metafazowe i jej dalszej dekondensacji po zakończeniu podziałów (Alexiadis i wsp., 1998).

CHRAC nie jest zdolny do przebudowy struktury mononukleosomów (na wzór NURF i SWI/SNF), lecz jest w stanie przekształcać nieuporządkowane ich układy w pozycjonowane szeregi o minimalnej energii potencjalnej (Ito i wsp., 1997). Zdolność do przebudowy struktur nukleosomowych, jak i zdolność do porządkowania układu nukleosomów charakteryzuje także niedawno poznany ludzki kompleks remodelujący RSF (LeRoy i wsp., 1998; Kornberg i Lorch, 1999). Kompleks ten ma bardzo prostą budowę i składa się

z zaledwie dwu podjednostek: polipeptydu o masie 135 kDa o 75% homologii do białka ISWI Drosophila oraz z polipeptydu o masie 325 kDa o nieznanej dotychczas funkcji. Różne aktywności kolejnych remodelujących kompleksów wielobiałkowych przedstawia rysunek 11.


Next: Wyspecjalizowane aktywujące i reprymujące Up: Organizacja chromatyny Previous: Nukleosomy jako regulatory transkrypcji   Spis rzeczy
Tomasz Calikowski 2000-06-15