Next: Nukleosomy jako regulatory transkrypcji Up: Organizacja chromatyny Previous: Fosforylacja histonów   Spis rzeczy

Składanie nukleosomów w chromatynie

W trakcie fazy S cyklu komórkowego powieleniu ulega nie tylko DNA, lecz również otaczające go struktury chromatynowe. Uważa się, że struktura chromatyny ulega przejściowemu zaburzeniu w miejscu przejścia widełek replikacyjnych, i że nowe nukleosomy odkładane są na powstających potomnych niciach DNA.

Powstawanie chromatyny podczas replikacji składa się z dwu odrębnych procesów (Rys. 8; Krude, 1995). W trakcie pierwszego z nich dochodzi do bezpośredniego przenoszenia histonów z nukleosomów wyjściowych na powielone DNA i do odtworzenia nukleosomów, bez szczególnej preferencji dla wiązania się do którejś z dwu nici DNA (Rys. 8a) (Bonne-Andrea i wsp., 1990; Krude i Knippers, 1991; Gruss i wsp., 1993). Wydaje się, że w proces ten jest biernie inicjowany przez widełki replikacyjne.  Drugi, odrębny proces polega na odkładaniu na potomnych niciach DNA nukleosomów z rozpuszczalnych białek histonowych, syntetyzowanych podczas fazy S (Rys. 8b) (Wu i Bonner, 1981). W procesie tym uczestniczą liczne czynniki składania chromatyny (ang. chromatin assembly factors, CAFs) (Ito i wsp., 1997a). W ciągu ostatnich lat poznano wiele białek zdolnych do odkładania histonów na nici DNA w warunkach in vitro, lecz większość z nich składa nukleosomy bez jednoczesnej replikacji DNA i nie wykorzystuje świeżo zsyntetyzowanych histonów.

Pierwszy czynnik składania chromatyny (CAF1), wyizolowany z komórek ludzkich, jest zbudowany z trzech podjednostek: p150, p60 i p50. Ma on zdolność organizowania nukleosomów specyficznie na nowopowstającym DNA podczas replikacji (Smith i Stillman, 1989). Początkowo na DNA odkładane są histony H3 i H4 występujące w postaci tetrameru. W ten sposób tworzy się zawiązek nukleosomu. W drugim etapie dołączane są dwa dimery histonów H2A-H2B, przy czym do tej reakcji nie jest już potrzebny ani CAF1, ani jednoczesna replikacja DNA (Smith i Stillman, 1991).

Czynnik CAF1 wykazuje ścisłą specyficzność substratową względem acetylowanych form histonów H3 i H4 (Smith i Stillman, 1991). I tak histon H4 zostaje przejściowo zmodyfikowany w cytoplazmie na kilku resztach lizynowych ogona aminowego, a następnie jest transportowany do jądra, gdzie ulega wbudowaniu w replikowaną chromatynę: stwierdzono, że w komórkach człowieka histon H4 związany z CAF1 jest mieszaniną czterech izoform niezmodyfikowanej, acetylowanej w jednym, w dwu i w trzech miejscach (w stosunku jak 33:33:33:1 - na lizynie 5, 8 i 12) (Verrault i wsp., 1996). Z podobną sytuacją spotykamy się w przypadku histonu H3, chociaż jego miejsca acetylacji nie są tak silnie konserwowane ewolucyjnie jak ma to miejsce w histonie H4 ((Sobel i wsp., 1995).

Czynnik CAF1 został wyizolowany również z Drosophila i z drożdzy (Kaufman i wsp., 1997; Adams i Kamakaka, 1999). Czynnik drożdżowy ma podobną budowę co CAF1 człowieka i składa się z trzech podjednostek: Cac1/Rlf2, Cac2 i Cac3/Msi1 (Kaufman i wsp., 1997). Co ciekawe, ich utrata nie jest daje fenotypu letalnego, i nie prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego drożdży w fazie G2, co dzieje się wówczas, gdy chromatyna nie zostanie całkowicie złożona (na przykład w wyniku niedoboru świeżo zsyntetyzowanych histonów) (Kim i wsp., 1988). Może to świadczyć o istnieniu innych, niezależnych szlaków składania chromatyny. Przypuszcza się, że mogłyby do nich należeć alternatywne szlaki, w których uczestniczy drożdżowe białko Spt6p lub białka N1/N2 Xenopus (Kleinschmidt i Franke, 1982). Mimo to, mutacja w genach kodujących podjednostki CAF-1 wiąże się ze specyficznym wzorem acetylacji w ogonach  aminowych histonów i prowadzi do powiększenia jądra komórkowego oraz do defektów w wygaszaniu (ang.

silencing) heterochromatynowym miejsc HML i HMR, związanych u drożdży z typem płciowym. Podobne zaburzenia w utrzymaniu wygaszonego transkrypcyjnie stanu chromatyny występują u tych mutantów w telomerach i związane są z niemożnością utrzymania represyjnej struktury chromatynowej, w wyniku niecałkowitego lub niewłaściwego złożenia nukleosomów (Enomoto i Berman, 1998). Fenotyp ten udaje się odwrócić poprzez wprowadzenie do komórki drożdży dodatkowych kopii genów SIR2, SIR3 lub SIR4, kodujących białka strukturalne obecne w wygaszonej transkrypcyjnie heterochromatynie (Enomoto i Berman, 1998). W związku z tym powstało przypuszczenie, że przy nieobecności CAF1 odłożone nukleosomy mogą zawierać niewłaściwie zmodyfikowane histony, co powoduje ich niestabilne wiązanie do białek Sir i prowadzi do defektów wygaszania.

Szlak składania chromatyny przez czynnik CAF1 jest wrażliwy na właściwy poziom i stechiometrię histonów. I tak, usunięcie genów HIR, które regulują biosyntezę histonów prowadzi do spadku ich poziomu i stechiometrii, lecz nie ma wpływu na wygaszanie genów (Kaufman i wsp., 1998). Mimo to, jednoczesne usunięcie tych genów i podjednostek CAF1 prowadzi do pogłębienia derepresji wygaszania miejsc HM i telomerów. Może być to dowodem, że stan wygaszenia powstały przy nieobecności CAF1 jest zależny od ilości białek histonowych. Dodatkowym potwierdzeniem tej hipotezy był wynik doświadczenia z nadprodukcją histonów H3 i H4 w mutancie CAF1, w którym wygaszenie telomerów uległo wzmocnieniu (Kaufman i wsp., 1998).

W odkładaniu histonów H2A/H2B na tetramerze histonów H3-H4 związanych z DNA uczestniczy białko opiekuńcze (ang. chaperone) o masie 56 kDa - Nap1 (białko składania nukleosomu, ang. nucleosome assembly protein-1) (Ito i wsp., 1996). Podczas mitozy tworzy ono kompleks z cykliną B i kinazą Gin4p i ma wpływ na działanie kompleksu kinazy Cdc28/cykliny B (Adams i Kamakaka, 1999). Samodzielnie działające białko Nap1 zdolne jest do odkładania oktamerów histonowych wyłącznie w sposób nieuporządkowany. Do ich właściwego rozmieszczenia niezbędna jest aktywność wyspecjalizowanych kompleksów wielobiałkowych zawierających ATPazę (patrz dalsza część Wstępu).

Po odłożeniu histonów rdzeniowych powstająca chromatyna podlega procesowi dojrzewania, w wyniku którego zajściu następuje regularne rozmieszczanie nukleosomów. Chromatyna taka charakteryzuje się odpornością na trawienie DNazą I, obecnością zdeacetylowanego histonu H4, a u wyższych eukariontów również obecnością histonu H1. Do utworzenia struktury regularnie rozmieszczonych nukleosomów zarówno in vitro jak i in vivo niezbędny jest ATP (Kamakaka i wsp, 1993). Adenozynotrifosforan wykorzystywany jest przez liczne czynniki białkowe zaangażowane w budowę struktur chromatynowych (patrz dalsza część Wstępu). Jednym z nich jest ACF (wykorzystujący ATP czynnik składania i przebudowy chromatyny, ang. ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor), wyizolowany z Drosophila (Ito i wsp., 1997b, patrz dalsza część Wstępu).


Next: Nukleosomy jako regulatory transkrypcji Up: Organizacja chromatyny Previous: Fosforylacja histonów   Spis rzeczy
Tomasz Calikowski 2000-06-15