Next: Histon H1 w cytoplazmie Up: Biologiczna rola histonu H1 Previous: Wprowadzenie   Spis rzeczy

Histon H1 jako specyficzny regulator ekspresji genów

Oprócz roli elementu strukturalnego chromatyny, histon H1 może wywierać wpływ na ekspresję określonych genów. Ważna rola w tym procesie przypada nukleosomom o ustalonej pozycji (chociaż ostatnie doniesienia zdają się podważać rolę H1 w pozycjonowaniu nukleosomów, przynajmniej u orzęska Tetrahymena (Karrer i VanNuland, 1999)), a także modyfikacjom samego histonu H1. Ustalono na przykład, że fosforylacja histonu H1 jest niezbędna dla szybkiej aktywacji genów z długiego powtórzonego promotora mysiego wirusa guzów sutka (MMTV), przy czym reakcja zachodzi poprzez receptor glukokortykoidowy, w odpowiedzi na związanie hormonu (Lee i Archer, 1998; Thomas, 1999; patrz poprzednia część Wstępu). Przedłużająca się stymulacja hormonalna powoduje, że glukokortykoidy nie są już w stanie pobudzać promotora MMTV, a histon H1 ulega defosforylacji. Usunięcie hormonu odwraca ten efekt. Regulacja aktywacji przez fosforylację H1 wykazuje przy tym specyficzność genową. Mimo, że do defosforylacji H1 dochodzi na terenie całej chromatyny, nie zmienia się poziom transkrypcji innych genów, nawet tych pobudzanych przez glukokortykoidy (np. metalotioneiny). Co ciekawe, nadprodukcja histonowego wariantu H1 (H1\( ^{o} \) lub H1c) w ssaczej linii komórkowej BALB/c 3T3, zawierającej promotor MMTV, powoduje gwałtowny wzrost ekspresji z tego promotora, oraz opóźnia utratę aktywności promotora MMTV, związaną z przedłużającym się działaniem hormonu (Gunjan i Brown, 1999). Sugeruje się, że taki efekt może być związany z bezpośrednim wpływem histonu H1 na strukturę nukleosomową regionu promotora, a także, że w procesie tym może dochodzić do nasilenia acetylacji histonów rdzeniowych.

Innym, niezwykle dokładnie zbadanym układem, w którym histon H1 wywiera wpływ na ekspresję genów jest kontrola transkrypcji rodziny genów 5S rRNA afrykańskiej żaby szponiastej Xenopus laevis (Bouvet i wsp., 1994; Schlissel i Brown, 1984). Geny należące do tej rodziny dzielą się na dwie klasy: na oocytarne geny 5S, obecne w haploidalnym genomie w liczbie 20000 kopii, i ulegające transkrypcji podczas rozwoju komórki jajowej, lecz następnie stopniowo wygaszane w rozwoju zarodkowym po stadium środkowej blastuli (ang. mid-blastula transition, MBT), i nieaktywne w wszystkich komórkach somatycznych, oraz na somatyczne geny 5S, obecne w liczbie 400 kopii w genomie haploidalnym, i których transkrypcja rozpoczyna się w oocytach od stadium MBT, i trwa również w komórkach somatycznych. Obie sekwencje genowe są niemal dokładnie takie same, chociaż różnią się ich sekwencje otaczające: geny oocytarne otoczone są sekwencjami bogatymi w pary AT, zaś geny somatyczne w pary GC. Sekwencje otaczające geny 5S rRNA mają decydujące znaczenie dla różnicowego hamowania transkrypcji przez histon H1 (Jerzmanowski i Cole, 1990); ekspresja histonu H1 rozpoczyna się podczas stadium MBT, i to właśnie pojawienie się białka H1 w tej fazie i związanie do sekwencji AT-bogatych (nie zaś GC-bogatych) prowadzi do różnicowej ekspresji genów 5S rRNA. Udowodniono, że także sama domena globularna H1 jest w stanie wywołać przełączenie ekspresji

genów (Vermaak i wsp., 1998). Z drugiej strony, ustalono, że usunięcie somatycznego histonu H1 in vivo poprzez zastosowanie specyficznego rybozymu, prowadzi do utrzymania ekspresji oocytarnych genów 5S rRNA w fazach rozwoju zarodkowego, w których geny te ulegają normalnie wyłączeniu (Kandolf, 1994).

Oba rodzaje genów wykorzystują te same czynniki transkrypcyjne, a w szczególności TFIIIA, wiążący się do wewnętrznej sekwencji kontrolnej genów 5S RNA. Różna siła wiązania się histonu H1 do sekwencji bogatych w pary AT i GC powoduje, że oktamery nukleosomowe zajmują odmienne pozycje na genach oocytarnych i somatycznych, odsłaniając w różnym zakresie miejsca wiązania dla TFIIIA. Tym samym, oocytarne i somatyczne sekwencje genowe różnią się powinowactwem do TFIIIA i H1 (Howe i Ausió, 1998)  nukleosom położony na sekwencji oocytarnej ma wyższe powinowactwo do H1, niż do TFIIIA, którego miejsce wiązania położone jest wewnątrz nukleosomu, i tym samym ulega represji. Nukleosom zawierający somatyczny gen 5S wiąże TFIIIA, którego miejsce wiązania leży na skraju nukleosomu, i pozostaje aktywne transkrypcyjnie (Panetta i wsp., 1998). Udowodniono bowiem, że wiązanie histonu H1 nie blokuje transkrypcji z somatycznych nukleosomów X. laevis (Howe i wsp., 1998), chociaż w przypadku nukleosomów oocytarnych histon jest w stanie oddziaływać z bogatymi w pary AT sekwencjami otaczającymi, prowadząc wspólnie z samym genem oocytarnym do reorganizacji struktury chromatyny na długości co najmniej kilku nukleosomów, i do represji transkrypcyjnej (Tomaszewski i Jerzmanowski, 1997; Tomaszewski i wsp., 1998). W tym przypadku, wynikiem działania histonu H1 jest rozsuwanie i formowanie szeregów silnie spozycjonowanych nukleosomów, co może leżeć u postawy tworzenia chromatynowych struktur wyższego rzędu. Co więcej, represja transkrypcyjna, wywoływana przez histon H1 wiążący się do oocytarnego genu 5S RNA i jego sekwencji otaczających, dotyczy nie tylko genów transkrybowanych przez polimerazę III RNA (jak sam gen 5S rRNA), lecz także genów docelowych polimerazy II RNA.

Xenopus jest niezwykle interesującym układem umożliwiającym badanie wpływu histonu H1 również na inne geny niż 5S RNA, a tym samym również na inne programy rozwojowe. Przy wykorzystaniu wycinków zarodków ze stadium moruli udało się ustalić, że histon H1 jest odpowiedzialny za utratę przez tkanki zdolności do rozwoju w kierunku linii mięśniowej (kompetencji mezodermalnej) (Steinbach i wsp., 1997). H1 nagromadzający się podczas fazy MBT powoduje zmniejszenie (zarówno czasowe, jak i przestrzenne) transkrypcji genu czynnika determinacji miogenicznej MyoD, oraz genu brachyury (bra), wykazującego również specyficzność mezodermalną. Użycie rybozymu skierowanego przeciwko mRNA histonu H1A pozwoliło na udowodnienie, że działanie histonu łącznikowego nie polega w tym przypadku na ogólnej represji chromatyny, lecz na specyficznej kontroli określonych genów. I tak, nie należy do nich gen rozwojowy GS17, gen c-fos, ani gen histonu H4, zaś należą geny MyoD i bra. Przedwczesna ekspresja histonów łącznikowych prowadzi zatem do przedwczesnej utraty zdolności do różnicowania w linię mezodermalną, podczas gdy obniżenie poziomu H1 przez działanie rybozymu wydłuża okres kompetencji mezodermalnej.

Powyższe obserwacje potwierdzają znaczenie, jakie histon H1 ma dla właściwej regulacji rozwoju Xenopus laevis. Z drugiej jednak strony, istnieje doniesienie, że usunięcie jedynego wariantu H1 wykrywanego podczas wczesnego rozwoju tego zwierzęcia, B4, nie ma wpływu na składanie chromatyny i powstawanie dorosłych żab (Dasso i wsp., 1994). Równie intrygująca była obserwacja, że także w rozwoju zarodkowym Drosophila nie wykryto białek przypominających H1 (Ner i Travers, 1994).

W celu ustalenia roli pełnionej przez histony łącznikowe w regulacji transkrypcji i ekspresji genów, przeprowadzono w ostatnich latach serię doświadczeń polegających na manipulacji poziomem tych białek w różnych układach badawczych in vivo. I tak, przy zastosowaniu techniki homologicznej rekombinacji powiodła się próba usunięcia z genomu drożdży genu HHO1, kodującego histon H1 (Patterson i wsp., 1998; Escher i Schaffner, 1997). Szczep drożdży pozbawiony H1 był żywotny i nie wykazywał zaburzeń w wygaszaniu telomerów, ogólnej represji transkrypcyjnej, odległej aktywacji genów, ani w rozmieszczeniu nukleosomów, chociaż doszło w nim do 2  3-krotnego  podniesienia ekspresji niektórych genów (np. CYC1). Z podobnym obrazem fenotypowym mamy do czynienia zarówno w przypadku orzęska Tetrahymena, którego można było pozbawić histonu H1 w dużym jądrze (makronuklusie) bez wpływu na ogólny profil transkrypcyjny i żywotność komórek (Shen i wsp., 1995; Shen i Gorovsky, 1996), jak i u kropidlaka (grzyba z grupy workowców) Aspergillus nidulans, u którego usunięcie jedynej kopii genu histonu H1 nie prowadzi do jakichkolwiek zmian fenotypowych (Ramon i wsp., 2000). Trzeba jednak pamiętać, że zarówno histon H1 z drożdży, jak i z Tetrahymena wykazują się nietypową budową (patrz poprzednia część Wstępu); na przykład drożdżowy H1 zawiera dwie domeny globularne, z których pierwsza wykazuje zaledwie 36% homologię do globuli H1 człowieka, a druga 43% (Escher i Schaffner, 1997). Tego typu różnica budowy histonów łącznikowych umożliwiła przeprowadzenie heterologicznej nadekspresji wszystkich siedmiu ludzkich wariantów H1 w drożdżach, bez skutków ubocznych dla tych ostatnich (Albig i wsp., 1998). Z kolei u myszy, usunięcie jednego z siedmiu zasadniczych wariantów H1, histonu H1\( ^{o} \), nie wywołało żadnych zaburzeń anatomicznych ani histologicznych w rozwoju (Sirotkin i wsp., 1995). Zwierzęta rozwijały i rozmnażały się normalnie, mimo że całkowicie nieobecne białko H1\( ^{o} \) nie ulegało zastępowaniu przez inny wariant H1 (Sirotkin i wsp., 1995). Również całkowite usunięcie poprzez rekombinację homologiczną innego wariantu histonu H1 u myszy, H1a (H1.1), nie zaburza ani wzrostu, ani spermatogenezy i płodności zwierząt (Rabini i wsp., 2000). U myszy 10 20 krotna nadprodukcja na poziomie mRNA ludzkiego histonu H1\( ^{o} \) nie prowadzi do jakichkolwiek zmian anatomicznych, histologicznych i rozwoju, chociaż temu wzrostowi nie towarzyszyła nadprodukcja obserwowana na poziomie białka (Tonjes i wsp., 1997). Z drugiej strony, nadprodukcja histonu H1\( ^{o} \) w mysich fibroblastach była jednak w stanie wywołać represję transkrypcyjną; co więcej, ustalono, że jest za nią odpowiedzialna środkowa, globularna część histonu H1 (Brown i wsp., 1997). Stwierdzono także, że do proliferacji kurzych komórek DT40 wystarczająca jest obecność tylko jednego z sześciu wariantów histonu łącznikowego (Takami i Nakayama, 1997), przy czym w liniach komórkowych, z których usunięto pięć spośród sześciu wariantów H1, nie zaobserwowano jakichkolwiek zmian w tempie wzrostu, ani w ogólnej strukturze chromatyny, chociaż stwierdzono rozległe zmiany w ekspresji genów. Podobny efekt wywołało w tej samej linii komórkowej również usunięcie jednego wariantu histonu łącznikowego, H1\( ^{o} \), co potwierdziła dwukierunkowa elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym (2D-PAGE) (Seguchi i wsp., 1995). Potencjalnie interesującą obserwacją było ponadto stwierdzenie, że pozostawienie tylko jednego genu dla histonu H1 prowadzi do jednoczesnego podwojenia zawartości białek HMG w chromatynie (Takami i Nakayama, 1997). Nieco inne wnioski wypływają natomiast z doświadczeń, w których usunięto histon H1 u grzyba Ascobolus immersus: chociaż wygaszanie genów zależne od metylacji nie ulega zmianom i szczepy pozbawione H1 rozmnażają się i rosną normalnie, to struktura ich chromatyny ulega rozluźnieniu, zaś same kolonie w gwałtowny sposób ulegają zablokowaniu we wzroście po osiągnięciu dojrzałego wieku (Barra i wsp., 2000). Wskazuje to na udział H1 w regulacji specjalistycznych programów rozwojowych, co sugerują również inne dane (patrz dalej).

Badania nad biologiczną rolą histonu H1 przeprowadzono również u roślin. Rzodkiewnik pospolity Arabidopsis thaliana zawiera trzy geny kodujące zarówno dwa warianty histonu łącznikowego, o niemal identycznej masie cząsteczkowej (His1-1 i His1-2) (Gantt i Lenvik, 1991), jak i wariant His1-3 o mniejszej masie cząsteczkowej, występujący w znacznie mniejszej ilości niż dwa główne subtypy (Ascenzi i Gantt, 1997). Ostatnio ustalono, że roślinne geny histonów łącznikowych mogą podlegać ekspresji w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne: i tak, ekspresja histonu His1-3 Arabidopsis ulega indukcji pod wpływem przewlekłego stresu suszy, lecz nie pod wpływem nagłego odwodnienia, zimna, lub wysokiego stężenia soli (Ascenzi i Gantt, 1997). Co więcej, w roślinach nie narażonych na działanie stresu wariant His1-3 jest wyrażany niemal wyłącznie w nowopowstających korzeniach przybyszowych, natomiast w roślinach poddanych stresowi wodnemu głównym miejscem jego ekspresji jest merystem korzeniowy i strefa wydłużania korzenia. Natomiast w pędach, ekspresja H1-3 jest najwyższa w młodych tkankach (Ascenzi i Gantt, 1999a). Przy pomocy przeciwciał specyficznych względem wszystkich trzech wariantów H1 Arabidopsis ustalono także, że w przeciwieństwie do dwóch głównych wariantów histonu łącznikowego (His1-1 i His1-2) wariant indukowany stresem (His1-3) wiąże się do innych miejsc na chromosomach, kontaktując się głównie z sekwencjami nierepetetywnymi (Ascenzi i Gantt, 1999b), nawet w roślinach poddanych stresowi. U podłoża tego zjawiska leży być może regulacja hormonalna. Na przykład u pomidora (Lycopersicon esculentum) odkryto wariant H1, którego ekspresję regulują fitohormony gibereliny (van Heuvel i wsp., 1999). Również  ekspresja  wariantu His1-3 Arabidopsis jest zależna od zewnętrznego bodźca poziomu sacharozy (Ascenzi i Gantt, 1999a); podniesienie stężenia tego cukru w pożywce dla roślin z 1% do 3% powodowało podniesienie poziomu  ekspresji His1-3, podobnie jak ma to miejsce w przypadku genu patatyny, indukowanego sacharozą (Martin i wsp., 1997). Podobny związek indukcji ekspresji histonu łącznikowego zależnej od bodźca zewnętrznego nie został jak do tej pory wykryty u innych organizmów niż rośliny, co może wynikać z ich specyficznego trybu życia, związanego ściśle z miejscem osiedlenia się.  Z kolei u tytoniu występuje co najmniej sześć wariantów histonu H1, których poziom i stechiometria ma decydujące znaczenie dla ekspresji

genów rozwojowych, a w konsekwencji ważnych programów rozwojowych, takich jak kwitnienie (Prymakowska-Bosak i wsp., 1999). Jednym z tytoniowych wariantów H1 jest H1-2, wyrażany we wszystkich tkankach rośliny, i wykazujący charakterystyczne oscylacje ekspresji w zależności od cyklu dobowego (Szekeres i wsp., 1995): poziom ekspresji podnosi się pod koniec fazy jasnej, i opada w trakcie fazy ciemnej. Ekspresja genu dla tego wariantu H1 ulega szybkiemu pobudzeniu również w kiełkujących nasionach.

U Arabidopsis, zarówno rośliny o drastycznie obniżonym poziomie wariantu His1-3 (poprzez technikę transformacji antysensownym transkryptem), ani rośliny nadeksprymujące ten wariant, nie wykazywały jakichkolwiek zaburzeń fenotypowych, jak i różnic w odpowiedzi na stres wodny (Ascenzi i Gantt, 1999a). Natomiast w  tytoniu, 2 - 3 krotne podniesienie poziomu histonów łącznikowych (połączone z obniżeniem poziomu określonych własnych wariantów H1) poprzez heterologiczną ekspresję histonu His1-2 z Arabidopsis prowadziło do zmian fenotypowych o różnym natężeniu, chociaż otrzymane rośliny były żywotne (Prymakowska-Bosak i wsp., 1996). Zmiany anatomiczne obejmowały karłowaty pokrój, zaburzenia kwitnienia i budowy kwiatów (częstym obrazem fenotypowym było wydłużenie słupka w stosunku do pręcików, czyli heterostylia) oraz zaburzenia owocowania, a także charakterystyczne zmiany morfologii komórek miękiszowych i ich jąder: chromatyna jądrowa obserwowana w transmisyjnym mikroskopie elektronowym przybierała charakterystyczną ciemną barwę, odpowiadającą strukturze elektronowo gęstej (Ślusarczyk i wsp., 1999; Prymakowska-Bosak i wsp., 1997). Jednocześnie chromatyna otrzymana z komórek nadprodukujących histon H1 nie wykazywała zaburzeń w  rozmieszczeniu nukleosomów.

Dosyć podobny, chociaż jeszcze głębszy i bardziej złożony obraz fenotypowy wywołało doświadczalne zmniejszenie poziomu głównych wariantów histonów łącznikowych u tytoniu, połączone z wzrostem poziomu mniejszych wariantów histonu H1 (Prymakowska-Bosak i wsp., 1999). Rośliny, w których przy pomocy techniki transformacji antysensownym cDNA zmniejszono poziom głównych wariantów somatycznych histonu H1, H1A i H1B, wytwarzały nadmiar mniejszych wariantów, H1C F, z których dwa, H1C i H1D, wykazywały wysoką homologię do wariantu His1-3 Arabidopsis indukowanego stresem suszy (Prymakowska-Bosak i wsp., 1999), zaś dwa pozostałe, H1E i H1F, znacznie mniejsze niż typowe roślinne histony łącznikowe, takiej homologii nie wykazywały. Rośliny były żywotne i nie wykazywały zaburzeń mitozy ani rozmieszczenia nukleosomów, chociaż dochodziło w nich do rozluźnienia struktury chromatyny i zaburzeń w męskiej linii rozwojowej podczas mejozy, czego objawem była niezdolność do wytwarzania płodnych ziaren pyłku, kwiatów i nasion, oraz owoców. Dodatkowo, zaburzeniu ulegał profil transkrypcyjny niektórych genów związanych z kwitnieniem, takich jak Nap3 (homolog genu homeotycznego APETALA3 (AP3) Arabidopsis) i Ta29 (kodującego białko bogate w glicynę, specyficzne dla tapetum woreczka pyłkowego), przy czym zmiany nie dotyczyły miejsca ekspresji, ale jej czasu. Brak histonu H1 nie miał natomiast wpływu na profil ekspresji (zarówno przestrzenny, jak i czasowy) innego genu, Ta25, kodującego aktynę specyficzną dla pyłku, ani konstytutywnie wyrażanych genów Pbf46 i Ubp1 (Prymakowska-Bosak i wsp., 1999). Inne zaburzenia w tych roślinach związane były z deformacją nasion pyłku, które wykazywały zaburzenia cytokinezy i podziałów mejotycznych, a także nie były zdolne do przebycia następującego po mejozie pierwszego podziału mitotycznego, przez co były pozbawione komórki generatywnej i wegetatywnej, pozostając w stanie niezróżnicowanym.

Badania nad rolą histonu H1 przeprowadzone przy wykorzystaniu tytoniu jako modelowego organizmu potwierdzają przypuszczenie, że białko to może uczestniczyć w specyficznej regulacji ekspresji określonych genów, nie jest zaś ogólnym represorem transkrypcji. Jednak w tym miejscu rola histonu łącznikowego się nie kończy. Przez ostatnie lata nagromadziło się wiele doniesień wskazujących na inne, mniej typowe, funkcje histonów łącznikowych, w tym te pełnione przezeń w cytoplazmie, jak i poza nią.



Subsections
Next: Histon H1 w cytoplazmie Up: Biologiczna rola histonu H1 Previous: Wprowadzenie   Spis rzeczy
Tomasz Calikowski 2000-06-15