Next: Ogony histonów i oddziaływania Up: Histony i nukleosomy Previous: Histony rdzeniowe i nukleosom   Spis rzeczy

Histony łącznikowe

Histon łącznikowy H1 wiąże się do nukleosomu ułatwiając organizowanie się nukleosomów w struktury wyższego rzędu (Finch i Klug, 1976; Thoma i wsp., 1979). Białko to nie podlega równie silnej konserwacji ewolucyjnej co pozostałe histony. Znanych jest wiele wariantów sekwencyjnych H1, występujących w określonych tkankach lub etapach rozwoju danego organizmu. Na przykład w erytrocytach ptaków zamiast histonu H1 występuje głównie histon H5, w którym wiele reszt lizynowych zastąpione zostało przez reszty argininowe. Histony łącznikowe niemal wszystkich typów charakteryzują się podobną budową: zawierają centralną domenę globularną, odporną na proteolityczne działanie trypsyny i bogatą w aminokwasy hydrofobowe, otoczoną przez końce (ogony) aminowy i karboksylowy o strukturze mało ustalonej w środowisku wodnym. Ogony są silnie zasadowe; w szczególności w końcu karboksylowym ponad połowę reszt  stanowią argininy i lizyny. Domena globularna utworzona jest z wiązki trzech ?-helis, i znajdującą się C-końcu strukturą ?-szpilki (struktura helisa-skręt-helisa, ang. helix-turn-helix, HTH) (Zlatanova i van Holde, 1996; Gajiwala i wsp., 2000). Białka tego typu składają się z trzech \( alpha \)-helis (H), trzech zwojów \( beta \) (Z) i trzech łączących je pętli (P), ułożonych w następującym porządku: H1-Z1-H2-P1-H3-P3-Z2-S1-Z3. Trzecia pętla łącząca drugi i trzeci zwój \( beta \) tworzy wystającą strukturę nazywaną skrzydłem (ang. wing) i oznaczoną symbolem S1. W niektórych białkach tego typu obecna jest jeszcze druga pętla skrzydła, S2. Obecność struktury tego typu pozwala na wydzielenie z grupy białek typu HTH podrodziny zawierającej motyw tak zwanej skrzydlatej helisy (ang. winged-helix motif). Obecny jest on m. in. w obszarze wiązania do DNA bakteryjnego białka CAP (białko aktywatora katabolicznego), w motywie rozpoznawania DNA z czynnika transkrypcyjnego - jądrowego receptora hepatocytów HNF-3/forkhead Drosophila i ssaków (Lai i wsp., 1993), oraz w histonie łącznikowym, mimo że sekwencje tych białek  i histonu H1/H5 wykazują niski stopień homologii (Clark i wsp., 1993). Układ trzech elementów strukturalnych histonu H1 (krótszego końca aminowego, globuli i dłuższego ogona karboksylowego) jest na tyle charakterystyczny, że stał się kryterium przynależności danego białka do rodziny H1. Mimo to, niektóre białka zaliczane do tej grupy na podstawie innych cech nie zawierają środkowej globuli. Należy do nich m. in. histon H1 z pierwotniaka (orzęska) Tetrahymena (Wu i wsp., 1986).

Część globularna w histonie H1 wykazuje najwyższy stopnień konserwacji ewolucyjnej; różnice sekwencyjne zarówno ewolucyjne, jak i pomiędzy różnymi wariantami z tej samej tkanki czy organizmu - zlokalizowane są głównie w silnie naładowanych ogonach. Za pomocą analizy NMR i dyfrakcji rentgenowskiej kryształów części globularnej histonu H1 stwierdzono przed kilkoma laty, że w obrębie cząsteczki obecne są dwa miejsca wiązania do DNA: jedno zawierające motyw skrzydlatej helisy umożliwiające wiązanie do dużej bruzdy DNA, zaś drugie w postaci silnie konserwowanego regionu bogatego w aminokwasy zasadowe, położone po drugiej stronie cząsteczki (Ramakrishnan i wsp., 1993).

Stanowi to wyjaśnienie zaobserwowanych cech tego białka: (i) zdolności histonu H1 do spinania dwóch cząsteczek DNA na powierzchni nukleosomu, (ii) preferencyjnego wiązania histonu łącznikowego do krzyżujących się podwójnych nici DNA (sztucznych czteroniciowych rozgałęzień) w stosunku do wiązania się do liniowego, dwuniciowego DNA, (iii) jego zdolności do zaginania DNA pomiędzy nukleosomami w ten sposób, że tworzy on strukturę łodyżki (ang. stem) (Vignali i Workman, 1998).

Białka zawierające motyw helisa-skręt-helisa wykorzystują do rozpoznawania i wiązania się do DNA powierzchnię trzeciej helisy (służącą do specyficznego wiązania się do dużego rowka DNA), pętlę S1 oraz koniec karboksylowy pętli S2.  Niedawno odkryto, że w pewnych białkach z tej grupy, takich jak białko hRFX1, przypominających strukturalnie globulę histonu H5, istnieje alternatywny sposób rozpoznawania DNA, w którym drugi i trzeci zwój ?, wraz z łączącą je pętlą skrzydłem S1, oddziałuje z dużym rowkiem DNA, podczas gdy ?-helisa H3 kontaktuje się z małym rowkiem (Gajiwala i wsp., 2000),. Do wiązania się globuli histonu H5 do dużego rowka DNA poprzez skrzydło S1 niezbędna jest obecność w białku konserwowanego aminokwasu, lizyny 85 (lub argininy 58 w białku hRFX1). Jego usunięcie w H5 poprzez zamianę na glutaminę lub kwas glutaminowy powoduje utratę zdolności ochrony nukleosomowego DNA przez globulę H5 przed trawieniem enzymatycznym (patrz dalsza część tego podrozdziału) (Buckle i wsp., 1992). Obecnie wydaje się, że białka typu HTH można podzielić na dwie klasy pod względem wykorzystywania każdego z obu dostępnych im sposobów oddziaływania z DNA: pierwsza grupa, do której zaliczają się takie białka jak HNF3 i E2F4 wiążą się do dużego rowka poprzez zasadową helisę trzecią, zaś do drugiej grupy można zaliczyć pozostałe białka, w tym globulę H5 i hRFX1, kontaktujące się z DNA poprzez zasadową pętlę skrzydło S1 (Gajiwala i wsp., 2000).

Trawienie chromatyny nukleazą z Micrococcus powoduje uwolnienie formy przejściowej, zwanej chromatosomem, który składa się z odcinka DNA długości 168 par zasad nawiniętych na oktamer nukleosomowy i związanego z nim histonu H1 (Noll i Kornberg, 1977, Rys. 3).

Dalsze działanie nukleazą powoduje odłączenie histonu H1 i strawienie kolejnego odcinka DNA długości 20 par zasad, uwalniając cząstkę rdzeniową nukleosomu zawierającą DNA o długości 146 par zasad (Rys. 3). DNA położone poza nukleosomami nosi nazwę DNA łącznikowego.

Centralna domena globularna histonu H1 zdolna jest do ochrony odcinka DNA długości 20 par zasad również wtedy, gdy N- i C-końcowy ogony zostały usunięte. Obecnie istnieje kilka konkurencyjnych modeli  wiązania cząsteczki histonu łącznikowego do nukleosomu.

Pierwszy z nich (Allan i wsp., 1980) przyjmuje, że histon łącznikowy leży na osi symetrii nukleosomu, wiążąc się do DNA wchodzącego i schodzącego z nukleosomu, tym samym chroniąc go przed strawieniem symetrycznie po obu stronach (10 par zasad z każdej z nich). Badania neutronowych widm dyfrakcyjnych chromatosomów i wiązania globularnej części H1 do natywnych nukleosomów wskazują jednak, że takie wiązanie może nie być symetryczne. Mimo to histon może łączyć się z dwiema nićmi DNA (po ich stronie zewnętrznej) za pomocą dwu obecnych w nim miejsc wiązania, chociaż niesymetrycznie względem osi nukleosomu (Rys. 4b, Zhou i wsp., 1998). W pracach tych, zmierzających do ustalenia miejsca wiązania histonu H1 do nukleosomu, wykorzystano chromatosomy pozbawione histonów łącznikowych, trawione nukleazą z Micrococcus. Takie chromatosomy poddawano następnie rekonstytucji, używając domen globularnych H1 poddanych uprzednio specyficznym mutacjom punktowym, zamieniających reszty seryny na reszty cysteiny. Możliwe było związanie tych ostatnich do DNA, a następnie zmapowanie miejsc oddziaływań poprzez trawienie alkaliczne. Badanie to pozwoliło na ustalenie, że histon łącznikowy wiąże się w pobliżu osi symetrii nukleosomu przy pomocy drugiego miejsca wiązania, podczas gdy motyw wiązania DNA typu skrzydlatej helisy wchodzi w kontakt z dużym rowkiem pierwszego skrętu helisy DNA chromatosomu. W ten sposób N-końcowy odcinek histonu łącznikowego zbliża się do DNA łącznikowego, zaś ogon C-końcowy do nici DNA wchodzących i opuszczających cząstkę nukleosomu, dzięki czemu możliwe są jego oddziaływania z którąkolwiek z nich. Od modelu tego znacznie odbiega obraz wiązania się histonu H1 do nukleosomu zaproponowany przez Wolffego i współpracowników (Rys. 4a, Pruss i wsp., 1996). Model ten zakłada, że H1 również wiąże się do nukleosomu asymetrycznie, kontaktując się z nukleosomowym DNA blisko 65 70 par zasad od osi symetrii, jednak proponuje, że do wiązania dochodzi wewnątrz zwojów DNA, a nie po ich stronie zewnętrznej. Histon miałby kontaktować się tylko z jedną helisą, co więcej, do wiązania dochodziłoby w oddaleniu od osi. Model ów oparty jest na anlizie wiązania się foto- i radioaktywnych sond molekularnych specyficznych względem dużego rowka DNA, do wyznakowanego radioizotopowo i zrekonstruowanego na nukleosomie odcinka DNA genu 5S rRNA afrykańskiej żaby Xenopus borealis. W oparciu o dane uzyskane z mapowania miejsc wiązania otrzymanych struktur zaproponowano model wiązania histonu łącznikowego wewnątrz zwojów DNA po jednej stronie analizowanej sekwencji. W ten sposób C-końcowa część histonu H1 znajdowałaby się na skraju nukleosomowego DNA, gdzie mogłaby wchodzić w kontakt z łącznikowym DNA. Model ten nie wyjaśnia jednakże zdolności wiązania DNA przez cząsteczkę histonu H1 za pomocą drugiego, mniej ustrukturalizowanego motywu wiązania, chociaż proponuje, że motyw ten mógłby służyć do kontaktów z sąsiednimi cząsteczkami nukleosomowymi, ułatwiając kondensację włókien nukleosomowych. Obecnie przyjmuje się, że model ten nie jest zgodny z danymi doświadczalnymi, i powinien zostać odrzucony.

Badania zmian konformacji zależnych od stężenia soli za pomocą mikroskopu elektronowego pozwoliły na stwierdzenia, że histony łącznikowe pełnią ważną funkcję w wytwarzaniu i utrzymywaniu struktur chromatynowych wyższego rzędu (Finch i Klug, 1976). Za pierwszą z tych struktur uznano układ sześciu nukleosomów  przypadających na jeden skręt superhelisy i skręconych wzdłuż włókna o długości około 11 nm i grubości 30nm (struktura solenoidu, Rys. 5). Nowsze prace z użyciem promieniowania jonizującego zdolnego do wywoływania pęknięć w sąsiadujących ze sobą miejscach w DNA dowodzą, że sąsiadujące nukleosomy tworzą strukturę zygzakowatą, w której DNA łącznikowy przebiega właściwie w prostej linii, zaś DNA nukleosomowy ma ustaloną pozycję rotacyjną (Rydberg i wsp., 1998). Chromatyna jest zdolna do kondensacji nawet przy braku histonu H1, wraz z wzrostem stężenia soli, jednak struktura jej włókien jest  wówczas zaburzona. Również struktura włókien chromatynowych rozprostowanych przy niskiej sile jonowej zależna jest od obecności histonu H1: w chromatynie zawierającej histon H1 DNA wchodzi i opuszcza nukleosomy po tej samej stronie, dając charakterystyczny zygzakowaty obraz rozprostowanych włókien, podczas gdy w chromatynie pozbawionej histonu łącznikowego miejsca wejścia i zejścia DNA z nukleosomu są znacznie bardziej przypadkowe, dając strukturę koralików na nitce (Thoma i wsp., 1979).

Z nietypową budową histonu H1 mamy do czynienia u drożdży. Jak do tej pory nie wyizolowano z nich cząsteczek tego białka, co może świadczyć o tym, że do kondensacji jego chromatyny histon łącznikowy nie jest potrzebny. Mimo to,  poznanie pełnej sekwencji genomu Saccharomyces cerevisiae pozwoliło na ustalenie, że zawiera on otwartą ramkę odczytu kodującą przypuszczalny homolog histonu H1 (Hho1p), chociaż  homologia ogranicza się tu do środkowej globuli (Ushinsky i wsp., 1997; Landsman, 1996). Co dziwniejsze, białko to posiada dwie takie globulę o długości około 80 aminokwasów, przy czym jedna z nich niemal całkowicie zastępuje koniec karboksylowy obecny w kanonicznym histonie H1. Podjęto również próbę ustalenia biologicznej funkcji tego histonu u drożdży (patrz dalsza część Wstępu).


Next: Ogony histonów i oddziaływania Up: Histony i nukleosomy Previous: Histony rdzeniowe i nukleosom   Spis rzeczy
Tomasz Calikowski 2000-06-15