Next: Mikroskopia epifluorescencyjna Up: Metody mikroskopowe Previous: Mikroskopia świetlna   Spis rzeczy

Mikroskopia immunofluorescencyjna

Próbki przygotowywane dla mikroskopii immunofluorescencyjnej utrwalano przez 2 godziny w 4% paraformaldehydzie w buforze PIPES (kwas 1,4-piperazodietanosulfonowy, 0,05 M, pH 7,0) w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu preparaty poddawano 30 min trawieniu 0,5% cellulazą i przenoszono na 15 min do 1% Tritonu X-100 w buforze PIPES. Próbki płukano przez 15 min tym samym buforem, a następnie zgniatano na szkiełkach mikroskopowych opłaszczonych poli-L-lizyną. Preparaty inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4\( ^{o} \)C w solnym buforze fosforanowym (PBS, 0,46 M NaCl, 3 mM KCl, 0,2 M Na2HPO4, 32 mM KH2PO4) zawierającym mysie przeciwciało pierwszorzędowe skierowane przeciwko \( beta \)-tubulinie (Sigma), rozcieńczone w stosunku 1:200 oraz sprzężone z fluoresceiną (FITIC, Sigma) kozie przeciwciało drugorzędowe skierowane przeciwko mysiemu przeciwciału pierwszorzędowemu, rozcieńczone w PBS w stosunku 1:150. Próbki barwiono następnie DAPI (1 ?g/ml) i zatapiano w mieszance glicerolowej citifluor. Obserwacje prowadzono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Microphot 5A.



Tomasz Calikowski 2000-06-15