Next: Elektroforeza białek Up: Materiały i metody Previous: Ekstrakcja całkowitych histonów z   Spis rzeczy

Trawienie chromatyny komórek BY-2 nukleazą Micrococcus

W celu trawienia chromatyny nukleazą Micrococcus (MNazą, nukleazą mikrokokalną) stosowano procedurę izolacji chromatyny opisaną powyżej (Moehs i wsp., 1988), z następującymi modyfikacjami. Po rozdrobnieniu materiału w homogenizatorze Waringa materiał (4 gramy odsączonej, tygodniowej zawiesiny komórek) zwirowywano, a osad zawieszano w buforze II w homogenizatorze Pottera. Procedurę tę powtarzano jeszcze raz, zawieszając osad w 40 ml buforu do nukleazy mikrokokalnej (1 M sorbitol, 0,1 M CaCl2, 10 mM PIPES (kwas 1,4-piperazodietanosulfonowy), świeży 0,1 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonowy)). Próbki wirowano następnie przez 40 minut przy 18000 obrotach na minutę, zaś osad zawieszano w 1,2 ml buforu do MNazy i dzielono na równe porcje. Porcje te podgrzewano przez 5 minut do temperatury 37\( ^{o} \)C, dodawano do nich 120 U enzymu (Fermentas, Wilno, Litwa), i inkubowano w 37\( ^{o} \)C przez ściśle określony czas (0, 1, 3, 10 minut). Reakcję zatrzymywano przez dodanie równej objętości buforu STOP (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 15 mM EDTA, 15 mM EGTA, 150 mM NaCl, 0,3% SDS) i poprzez przeniesienie do temperatury lodu (0\( ^{o} \)C).


Next: Elektroforeza białek Up: Materiały i metody Previous: Ekstrakcja całkowitych histonów z   Spis rzeczy
Tomasz Calikowski 2000-06-15