Next: Otrzymywanie kompetentnych bakterii Agrobacterium Up: Materiały i metody Previous: Hodowla zawiesiny komórkowej BY-2   Spis rzeczy

Przygotowanie bakterii kompetentnych Escherichia coli i ich transformacja metodą szoku cieplnego lub przez elektroporację.

Do przygotowania bakterii zdolnych do wydajnego pobierania plazmidowego DNA wykorzystywano szczep E. coli DH5? lub XL1-Blue. Bakterie szczepiono do pożywki LB i hodowano przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 37\( ^{o} \)C. 100 \( mu \)l nocnej hodowli przenoszono do 50 ml czystej pożywki LB i hodowano aż do uzyskania przez bakterie gęstości optycznej równej 0,6 (przy długości fali 550 nm). Bakterie ochładzano w lodzie i po dokładnym odsączeniu pożywki zawieszano w 8 ml buforu FSB (10 mM octan potasu, 10% glicerol, 0,1 M KCl, 0,05 M CaCl\( _{2} \) ?H\( _{2} \)O, pH 6,2 (HCl)). Bakteria zwirowywano dwukrotnie przez 5 minut przy 6000 obrotach na minutę, zawieszając w buforze FSB i przechowywano w temperaturze -80\( ^{o} \)C. W celu transformacji bakterii wykorzystywano metodę szoku cieplnego (szczep DH5\( alpha \)), (Sambrook i wsp., 1989), lub elektroporację (szczep XL1-Blue). W trakcie pierwszej metody, do zawiesiny bakterii pozostającej w lodzie dodawano 50 100 ng DNA i inkubowano przez 30 minut, po czym na 5 minut przenoszono próbówkę do 37\( ^{o} \)C, a następnie ponownie do lodu, na pięć minut. Do próbek dodawano 700 \( mu \)l płynnej pożywki LB i umieszczano w 37\( ^{o} \)C na 45 minut, celem umożliwienia bakteriom wyrażenia genu odporności na antybiotyk selekcyjny, po czym wysiewano 200 \( mu \)l zawiesiny bakteryjnej na szalkę z odpowiednim antybiotykiem i hodowano przez noc w temperaturze 37\( ^{o} \)C. W przypadku bakterii wyrażających odporność na kanamycynę, okres wyrażania przedłużano do 90 minut. Do transformacji E. coli używano również elektroporatora GenePulser firmy  BioRad, poddając komórki XL1-Blue krótkim impulsom elektrycznym o napięciu 2,5 KV, pobudzając je do pobierania obcego DNA. W celu przygotowania preparatu DNA do podania bakteriom w drodze elektroporacji, odsalano go na membranach dializacyjnych Millipore 0,22 \( mu \)m wobec sterylnej wody destylowanej przez 10 minut, w temperaturze pokojowej, po czym umieszczano w schłodzonej kuwecie elektroporacyjnej BioRad (średnica szczeliny 1 mm) razem z zawiesiną bakterii. Po poddaniu E. coli działaniu pola elektrycznego bakterie traktowano w identyczny sposób jak po szoku termicznym (cieplnym).



Subsections
Next: Otrzymywanie kompetentnych bakterii Agrobacterium Up: Materiały i metody Previous: Hodowla zawiesiny komórkowej BY-2   Spis rzeczy
Tomasz Calikowski 2000-06-15